Badania

Działalność naukowo - badawcza

 

Działalność naukowa jednostki skoncentrowana jest między innymi wokół poszukiwań nowych zastosowań enzymów w procesach technologicznych w przemyśle spożywczym i paszowym. Przykładem są badania służące opracowaniu efektywnej metody enzymatycznej izolacji pektyny, która byłaby alternatywą wobec stosowanej dotychczas metody kwasowej. Nasze zainteresowania obejmują również wykorzystanie fermentacji w podłożu stałym, z zastosowaniem szczepów grzybów strzępkowych i bakterii kwasu mlekowego do otrzymywania nowych produktów spożywczych. Interesują nas także bogate źródła bioaktywnych substancji (np. algi czy pseudozboża), do tej pory nie w pełni wykorzystane, które można zastosować w suplementacji lub produkcji nowego typu żywności funkcjonalnej. Profil badawczy Katedry obejmuje również izolacje i hodowle komórek pierwotnych nabłonka jelita oraz analizę ekspresji markerów różnicowania tych komórek. Szczególne znaczenie mają badania nad różnicowaniem komórek Caco-2 w trakcie transportu przez nabłonek alergenów pokarmowych i związków bioaktywnych.

Poniżej znajduje się szczegółowa lista aktualnie realizowanych w naszej jednostce prac, z wyszczególnieniem oczekiwanych efektów naukowych i praktycznych prowadzonych badań.

BADANIA WPŁYWU SUBSTANCJI BIOAKTYWNYCH POCHODZĄCYCH Z ŻYWNOŚCI
NA METABOLIZM, PROCESY RÓŻNICOWANIA I ZMIANY FENOTYPU KOMÓREK NOWOTWOROWYCH

   Produkty spożywcze oprócz składników odżywczych często zawierają różne związki bioaktywne, które nie są bezpośrednio metabolizowane, nie stanowią źródła energii czy materiału budulcowego dla organizmu, ale mimo to są bardzo ważne np. witaminy, antyoksydanty, czy związki o charakterze bakteriobójczym.  Część naszych badań koncentruje się na tym, jak wykorzystać niektóre naturalnie występujące w żywności związki bioaktywne (np. kwasy tłuszczowe z ryb, resweratrol z winogron czy sulforafan z warzyw kapustnych), aby działając na wewnątrzkomórkowe białka receptorowe zablokować określone szlaki metaboliczne. Szczególnie interesujące wydaje się zbadanie wpływu takich substancji na metabolizm i stan energetyczny komórki i możliwość zastosowania tych związków do wywołania w komórkach nowotworowych kryzysu metabolicznego prowadzącego do zahamowania proliferacji, migracji, oraz na końcu śmierci. Modelem komórek nowotworowych wykorzystywanym w badaniach są komórki linii gruczolakoraka okrężnicy Caco-2 oraz czerniaka B16 F10. Hodowle prowadzi się w warunkach sterylnych z wykorzystaniem komory laminarnej II klasy bezpieczeństwa przeznaczonej do pracy z materiałem patogennym oraz inkubatorem z atmosferą CO2 do hodowli komórkowych. Do obserwacji komórek wykorzystuje się odwrócony mikroskop z kontrastem fazowym, umożliwiający podgląd żywych komórek bez ich wybarwiania, natomiast obecność interesujących białek określa się z wykorzystaniem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym w obecności SDS w połączeniu z techniką immunoblottingu.

   Oczekiwanym efektem naukowym będzie poznanie wpływu badanych substancji bioaktywnych na receptory PPARs (receptory aktywowane proliferatorami peroksysomów) oraz określenie wpływu tych substancji na procesy różnicowania i zmiany fenotypu komórek.

   Efektem praktycznym może być wytypowanie substancji bioaktywnych z żywności, które można wykorzystać do tzw. terapii celowanej, mającej za zadanie wprowadzenie komórek nowotworowych w stan zaprogramowanej śmierci (apoptozy).

 

OPRACOWANIE WYDAJNEJ METODY ENZYMATYCZNEJ EKSTRAKCJI PEKTYN JABŁKOWYCH

   Polska jest trzecim na świecie (po Chinach i USA) producentem jabłek, a wytłoki będące odpadem z ich przetwarzania to w naszym kraju potencjalnie najlepszy surowiec do izolacji pektyny. Pektynę standardowo ekstrahuje się z wysuszonych i dokładnie rozdrobnionych wytłoków jabłkowych kwasami mineralnymi (HCl, HNO3, H2SO4) w podwyższonej temperaturze (80-100°C). Uzyskany w ten sposób polimer wykazuje bardzo dobre właściwości żelujące, ale niestety nie sprawdza się, jako emulgator. Celem naszych badań jest opracowanie warunków ekstrakcji, które pozwolą z dużą wydajnością wydobyć z wytłoków jabłkowych pektynę czynną biologicznie i jednocześnie zachowującą zarówno potencjał żelujący jak i emulgujący. Dla realizacji tego celu pektyna jest ekstrahowana z wytłoków jabłkowych przy użyciu preparatów monoaktywnościowych (celulaza, ksylanaza) i wieloaktywnościowych (preparaty handlowe) zdolnych do selektywnego jej odhydrolizowania od pozostałych struktur ścian komórkowych. Następnie każda z otrzymanych w ten sposób pektyn jest dokładnie charakteryzowana pod kątem właściwości fizyko-chemicznym i biologicznych. W badaniach tego typu określa się lepkość i pH tworzonych przez pektynę roztworów, jej masę cząsteczkową, stopień metylacji i acetylacji, rodzaj i zawartość cukrów, kwasu galakturonowego, białek oraz fenoli, a także zdolność do tworzenia żeli i emulsji. Analizowane są także właściwości antyoksydacyjne i prebiotyczne otrzymywanych pektyn oraz ich wpływ na fizjologię i metabolizm komórek nowotworowych. W trakcie badań na etapie przygotowania ekstrakcji pektyn wykorzystuje się termostatowane łaźnie wodne i olejowe z wytrząsaniem, wirówki i suszarki laboratoryjne, natomiast na etapie analiz wykorzystuje się pH-metry, wiskozymetry, sonifikator, analizator wielkości cząstek metodą detekcji laserowej, spektrofotometr, wysokosprawny chromatograf cieczowy sprzężony z detektorami refraktometrycznym i elektrochemicznym, komorę laminarną do pracy z materiałem patogennym, inkubator z atmosferą CO2 do hodowli komórkowych oraz odwrócony mikroskop z kontrastem fazowym.

   Oczekiwanym efektem naukowym ma być poznanie zależności pomiędzy techniką izolacji pektyn jabłkowych a ich strukturą oraz pomiędzy tą strukturą a potencjałem emulgującym, żelującym, antyoksydacyjnym, prebiotycznym i antynowotworowym otrzymanych polimerów.

   Efektem praktycznym może okazać się opracowanie innowacyjnej metody pozyskiwania pektyn z wytłoków jabłkowych nie tylko spełniającej wymogi przemysłu spożywczego, ale także posiadającej lepszy od pektyn otrzymywanych konwencjonalnie potencjał biologiczny.

 

BADANIA ODDZIAŁYWANIA BAKTERII PROBIOTYCZNYCH
I LIGANDÓW RECEPTORÓW TOLL-PODOBNYCH
NA WZROST I RÓŻNICOWANIE KOMÓREK NABŁONKOWYCH JELITA CIENKIEGO
W MODELU ORGANOTYPOWEJ HODOWLI TRÓJWYMIAROWEJ

   Część z prowadzonych w naszej jednostce badań dotyczy wpływu mikrobioty jelitowej na zdrowie ludzi i zwierząt hodowlanych. Do badania tego zjawiska stosuje się modele in vitro oparte na prowadzeniu hodowli komórkowych nabłonka jelitowego oraz fibroblastów śluzówki jelit, a także hodowli organotypowych. Jednym z  modeli wykorzystywanych w naszej pracy doświadczalnej są mini-organy (organoidy) tworzące się spontanicznie poza organizmem w hodowli trójwymiarowej pochodzące z zarodkowych tkanek kurzych lub z dorosłych kur i myszy. Osiągnięciem naszego zespołu jest opracowanie nowych i unikalnych modeli organoidów jelitowych pochodzących z tkanek ptaków, oraz mysich organoidów w „wiszącej kropli”. Hodowle organoidów jelitowych („mini-jelitek”) tworzymy zanurzając fragmenty nabłonka (izolowane z jelit metodą inkubacji w buforach z dodatkiem związku chelatującego wapń) w żelu złożonym z białek macierzy zewnątrzkomórkowej (Matrigel™). Podobne organoidy uzyskujemy również zawieszając kroplę zawierającą nabłonek zarodkowych jelit w specjalnych wąskich kanalikach wielodołkowej płytki hodowlanej – w takich hodowlach siła ciężkości powoduje gromadzenie się wszystkich komórek w jednym miejscu, na dnie kropli.

   Wykorzystując te modele dotychczas pokazaliśmy, że wprowadzenie do hodowli organoidów jelitowych składników bakteryjnej ściany lub całych żywych bakterii powoduje, iż twory takie szybciej rosną i więcej komórek w ich obrębie dzieli się. Znakując fluorescencyjnie pałeczki Lactobacillus acidophilus LA5 uwidoczniliśmy – zwłaszcza w hodowlach w wiszącej kropli – bakterie znajdujące się wewnątrz tworzących się sfer, które mogą tam przetrwać przez wiele dni. W przeprowadzanych badaniach poszukiwaliśmy w komórkach organoidów niektórych receptorów błonowych z grupy toll-podobnych (TLR). TLR rozpoznają najczęściej „wzorce molekularne” występujące w komórkach mikroorganizmów, ale niepojawiających się w prawidłowych komórkach zwierząt wyższych.

   Oczekiwanym efektem naukowym tego projektu badawczego jest również ustalenie obecności receptorów typu TLR i ich lokalizacji w organoidach. Dotychczas, potwierdziliśmy obecność TLR4 oraz dwóch wariantów TLR2 charakterystycznych tylko dla ptaków (TLR2.1 i TLR2.2) w kurzych organoidach jelitowych. Pokazaliśmy również, w jaki sposób ligandy TLR (bakteryjny LPS i syntetyczny lipopeptyd, P3CSK4) wiążą się z tymi receptorami na komórkach organoidów.

   Prowadząc nasze badania korzystamy z pracowni hodowli komórkowej wyposażonej w komorę laminarną drugiej klasy bezpieczeństwa oraz z inkubatorów z atmosferą CO2. Wzrost i różnicowanie komórek oceniamy dzięki obserwacji za pomocą odwróconego mikroskopu świetlnego wyposażonego w komorę inkubacyjną zapewniającą stabilność hodowli poprzez regulację temperatury, poziomu CO2 i utrzymywanie wilgotności, co umożliwia nagrywanie filmów poklatkowych i odtworzenie zachowania organoidów, w tym ich wzrostu, fuzji i ruchu. Stosujemy również zaawansowane techniki mikroskopii fluorescencyjnej – barwiąc komórki przyżyciowo, lub metodami cytoimmunofluorescencji.

   Modele komórkowe przez nas opracowane mogą się okazać przydatne w wielu badaniach nad wzajemną relacją między nabłonkiem jelit a bytującymi w jelitach mikroorganizmami, zarówno symbiotycznymi, jak i wywołującymi choroby. Umożliwiają one również badania probiotycznych dodatków do żywności i pasz, stwarzając możliwość określenia ich potencjalnego prozdrowotnego działania.

 

OKREŚLENIE WPŁYWU FERMENTACJI W PODŁOŻU STAŁYM
NASION ROŚLIN STRĄCZKOWYCH ORAZ PSEUDOZBÓŻ
NA PARAMETRY ODŻYWCZE I ŻYWIENIOWE OTRZYMANYCH PRODUKTÓW
TYPU TEMPE I ONCOM

   Prowadzone badania dotyczą zastosowania fermentacji w podłożu stałym do przetwarzania substratów roślinnych w celu uzyskania produktów spożywczych o korzystnym składzie i walorach sensorycznych. Fermentacja w podłożu stałym, jako metoda produkcji i obróbki żywności pochodzenia roślinnego, jest powszechnie stosowana w wielu krajach Azji. Jednym z produktów spożywczych otrzymywanych w wyniku fermentacji w podłożu stałym jest tempe (synonim: tempeh), pochodzący z wyspy Jawa i rozpowszechniony w Indonezji. Produkt ten otrzymywany jest w wyniku fermentacji wstępnie ugotowanych, namoczonych i obłuskanych nasion soi najczęściej przy udziale kultur grzybów strzępkowych Rhizopus oligosporus. Pleśnie te, ze względu na charakter wzrostu umożliwiają otrzymanie w niedługim czasie (około 27 godzin inkubacji w temperaturze 30-37°C) produktu spożywczego o zwartej strukturze i delikatnym smaku. Sojowe tempe posiada wysoką wartość odżywczą, ze względu dużą zawartość łatwo przyswajalnego białka oraz obecność żelaza i witamin z grupy B. Ponadto przefermentowane nasiona są łatwiej trawione, a zawarte w nich składniki odżywcze są łatwiej przyswajalne. Wynika to z faktu, że przeprowadzenie fermentacji w podłożu stałym umożliwia zmniejszenie w nasionach poziomu wielu składników antyodżywczych, takich jak: fosforany mio-inozytolu, proteazy, inhibitory amylaz, lektyny oraz oligosacharydy z rodziny rafinozy. Fermentowane produkty typu tempe i oncom są także bogatsze w błonnik, szczególnie jego frakcję nierozpuszczalną. Krótki czas fermentacji i łatwość przeprowadzenia procesu zapewniają możliwość modyfikacji, której celem jest otrzymanie nowych produktów opartych na odmiennych od soi substratach łatwo dostępnych w Polsce i zapewniających otrzymanie wyrobu o korzystnych cechach.  Wśród wytypowanych nowych substratów są inne rośliny strączkowe (np. fasola zwyczajna, lędźwian siewny), pseudozboża, (np. pszenica orkiszowa, komosa ryżowa, gryka zwyczajna i tatarka) oraz odpady przemysłu spożywczego posiadające dużą zawartość białka (np. makuch lniany czy rzepakowy). W prowadzonych badaniach wykorzystywane są szczepy grzybów strzępkowych z gatunków Rhizopus oligosporus, Aspergillus oryzae, Neurospora intermedia oraz bakterie Lactobacillus plantarum. Przygotowane produkty zaszczepiane są zawiesiną zarodników w warunkach sterylnych pod komorą laminarną, do standaryzowania gęstości zawiesiny wykorzystuje się mikroskop optyczny wyposażony w komorę zliczeniową Thoma. Hodowle fermentacyjne prowadzone są na szalkach Petriego w cieplarkach z płaszczem elektrycznym lub wodnym. W gotowych produktach ilość substancji odżywczych, antyodżywczych oraz antyoksydantów określa się z wykorzystaniem technik spektrofotometrycznych i chromatograficznych.

   Efektem naukowym prowadzonych badań jest określenie wpływu fermentacji typu tempe i oncom na wartość odżywczą i zawartość witamin z grupy B oraz jej wpływ na potencjał antyoksydacyjny i poziom związków antyodżywczych w gotowym produkcie.

   Efektem praktycznym jest otrzymanie nowych wyrobów typu tempe i oncom na bazie nietypowych surowców, a posiadających ciekawe cechy smakowo-zapachowe oraz korzystne właściwości odżywcze i prozdrowotne. Otrzymane wyroby mogą również być dodatkami do żywności o wysokim potencjale bioaktywnym, warunkowanym zawartością rozpuszczalnych fenoli oraz aktywnych peptydów uwalnianych w wyniku hydrolizy białek roślinnych w trakcie procesu fermentacji.

 

ANALIZY PRODUKTÓW SPOŻYWCZYCH SUPLEMENTOWANYCH ALGAMI
ORAZ OKREŚLANIE PRZYSWAJALNOŚCI POCHODZĄCYCH Z NICH ZWIAZKÓW BIOAKTYWNYCH
W BADANIACH IN VITRO

   Algi określane też, jako glony to zróżnicowana grupa niespokrewnionych ze sobą organizmów (np. Spirulina i Chlorella), które łączy życie w środowisku wodnym, brak wykształconych tkanek i autotrofizm. Organizmy te budzą duże zainteresowanie w technologii żywności, ze względu na wysoką zawartość białka o korzystnym profilu aminokwasowym, a także obecność nienasyconych kwasów tłuszczowych, witamin oraz mikroelementów. W prowadzonych w naszej jednostce badaniach staramy się wykorzystać algi, jako dodatek do różnych produktów spożywczych w celu polepszenia ich parametrów odżywczych, prozdrowotnych i smakowych. Analizy przyswajalności składników pokarmowych i substancji bioaktywnych prowadzimy z wykorzystaniem standardowej metody trawienia in vitro oraz modelu opartego na komórkach linii Caco-2 naśladujących zachowanie nabłonka jelita cienkiego. Otrzymane dializaty i płyny pohodowlane poddawane są analizom spektrofotometrycznym, chromatograficznym oraz z wykorzystaniem atomowej spektrometrii absorpcyjnej. Uzyskujemy w ten sposób wyniki pozwalające określić przyswajalność badanych związków obecnych w algach i produkcie nimi wzbogaconym.

    Oczekiwanym efektem naukowym będzie określenie obecności i zawartości w produktach wzbogaconych glonami interesujących substancji bioaktywnych (m. in. witamin, fosforanów inozytolu, polifenoli) oraz poznanie ich przyswajalności w modelach symulujących trawienie w przewodzie pokarmowym człowieka.

   Efektem praktycznym może okazać się wytypowanie produktów spożywczych, u których suplementacja algami  poprawia właściwości odżywcze i prozdrowotne jednocześnie pozostawiając produkt smakowitym i atrakcyjnym wizualnie.

 

WYKORZYSTANIE PREPARATÓW ENZYMATYCZNYCH W PROCESIE PRODUKCJI
FUNKCJONALNEGO PIWA NA BAZIE SŁODU GRYCZANEGO
DO OPTYMALIZACJI EKSTRAKCJI ZWIĄZKÓW BIOLOGICZNIE AKTYWNYCH

   Podstawowy surowiec do wyrobu piwa stanowią ziarna jęczmienia lub pszenicy, co w przypadku osób chorych na celiakię powoduje reakcje alergiczne i nietolerancję tego napoju z uwagi na obecność immunorekatywnych epitopów białek głównie w hordeinach oraz gliadynach. Pseudozboża, takie jak gryka czy komosa, pozbawione są tych białek, a jednocześnie, ze względu na korzystny profil aminokwasowy, mogą stanowić interesujący materiał wyjściowy w browarnictwie. W przypadku gryki, dodatkowy aspekt wynika z wysokiej zawartości bioaktywnych inozytoli: D-chiro- oraz mio-inozytolu substancji o potencjalnym pozytywnym wpływie na indeks glikemiczny, własnościach immunomodulacyjnych oraz stymulujących wzrost komórek. Dzięki zastosowaniu niekonwencjonalnych składników na etapie słodowania bioaktywne i funkcjonalne własności piwa przeznaczonego dla specjalnej grupy konsumentów (piwo bezglutenowe) mogą zostać ulepszone. Przeszkodą na drodze uzyskania takie produktu są koszty produkcji, które dla piwa na bazie jęczmienia są znacznie niższe niż dla piwa gryczanego, głównie ze względu na niższą cenę surowca i wysoką aktywność endogennych enzymów hydrolizujących skrobię. Naszą propozycją obniżenia kosztów produkcji piwa bezglutenowego jest optymalizacja składu i dawki enzymów. W badaniach oprócz tradycyjnych amylaz stosujemy proteazy, celulazy oraz glukanazy umożliwiające rozluźnienie struktury tzw. super–glukanów obecnych w nasionach gryki oraz zniwelowanie wpływu niekorzystnej proporcji amylozy do amylopektyny (1:3) w skrobi gryczanej. Badania prowadzone są wspólnie z Katedrą Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej, a w naszej jednostce do analiz wykorzystujemy wysokociśnieniowy chromatograf cieczowy z detekcją refraktometryczną, elektrochemiczną, fluorescencyjną oraz UV-VIS.

     Efektem naukowym prowadzonych prac, będzie poznanie wpływu zastosowanych enzymów na poziom uwalnianych związków bioaktywnych (głownie inozytoli, sacharydów i peptydów).

   Głównym oczekiwanym efektem praktycznym będzie otrzymanie funkcjonalnego piwa bezglutenowego na bazie gryki, charakteryzującego się wysoką zawartością bioaktywnych inozytoli i peptydów oraz niską zawartością cukrów prostych.

 

Współpraca

Współpraca naukowa:

  • AB Enzymes OY, Finlandia
  • Instytut Zootechniki - Balice, Zakład Żywienia Zwierząt, Aleksandrowice
  • Louisiana State University, Health Sciences Center, New Orleans, USA
  • University of Missouri, Animal Science Research Center, Columbia, USA

Współpraca z przemysłem:

  • AB Enzymes GmbH, Darmstadt, Niemcy
  • Alima - Gerber S.A., Rzeszów
  • Instytut Biotechnologii Surowic i Szczepionek, BIOMED S.A., Kraków
  • Pektopol Sp. z o. o., Jasło

Propozycje dla przemysłu:

  • Wielofunkcyjne i wieloaktywnościowe biokatalizatory dla przemysłu paszowego.
  • Doradztwo i konsultacje w zakresie enzymatycznych modyfikacji technologii w przemyśle spożywczym i paszowym.

Zapraszamy firmy i instytucje do współpracy!

Otrzymane granty:

  • 2013 – 2017 NCN OPUS: „Wpływ bakterii probiotycznych oraz ligandów receptorów Toll-podobnych na wzrost i różnicowanie komórek nabłonkowych jelita cienkiego - badania w modelu organotypowej hodowli trójwymiarowej pochodzącej z zarodków kurzych”.
  • 2011 – 2015, FNP POMOST: „Molecular Mechanisms of anticancer effects of Peroxisome Proliferator Activated Receptor Ralpha acitvation by fatty acids and fenofibrate in tumor cells".
  • 2010 – 2011 Grant habilitacyjny NCN:1762: "Katechiny zielonej herbaty, jako naturalne stabilizatory wysokotłuszczowych produktów żywności pochodzenia zwierzęcego, o działaniu prozdrowotnym".
  • 2009 – 2012 Grant własny NCN:1706: "Wpływ mio-inozytolu oraz enzymatycznie generowanego mio-inozytolu na parametry produkcji, metabolizm P i Ca na odpowiedź immunologiczna u drobiu".
  • 2008 – 2011 Grant NCN: N N302 130834: "Model zróżnicowanego nabłonka jelita kurzego in vitro jako narzędzie do oceny immunomodulacyjnej roli śluzówki przewodu pokarmowego".
  • 2002 Grant promotorski 3 P06Z 072 22: "Profilowanie składu enzymów fosfolitycznych grzybni Aspergillus niger w celu wykorzystania jej jako biokatalizatora dla przemysłu drobiarskiego".
  • 2001 – 2004 Grant KBN 6 P06E 052 20: "Efekty żywieniowe różnicowania stopnia konwersji fitynianów przy zmiennych poziomach defosforylacji pasz".
  • 2001 – 2004 Grant zamawiany KBN PBZ-KBN/021/P06/31: "Produkty enzymatycznej konwersacji fitynianów jako składniki żywności funkcjonalnej".
  • 2001 – 2002 Grant promotorski 6 P06T 034 21: "Badania nad dostosowaniem preparatu pektolitycznego Pektopol PT 400 dla przemysłu paszowego".
  • 1997 – 2000 Grant United States Department of Agriculture: "Enzymes as a phosphorus management tools in poultry production" (wspólnie z dr David R. Ledoux, Animal Science Research Center, University of Missouri - Columbia).
  • 1996 – 1999 Grant KBN P06E 001 11: "Jednoczesne stosowanie enzymów fosfolitycznych i obniżających lepkość w paszach dla drobiu zawierających pszenicę".
  • 1991 Grant badawczy Ministerstwa Edukacji Narodowej RP: "Enzymatyczna konwersja fitynianów żywności i pasz".

 

Uniwersytet Rolniczy im. Hugona Kołłątaja w Krakowie
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie
Wydział Technologii Żywności
ul. Balicka 122
30-149
Kraków
12 662 47 48
12 662 47 48
wtzyw[a]urk.edu.pl
ESP:/URKRAKOW/wtz
© 2019 Uniwersytet Rolniczy im. Hugona Kołłątaja w Krakowie
Projekt i wykonanie strony: Dział Informatyki UR